TOME 199 N°1 - 2005

Séance du 17 décembre 2003

Thérapie des dystrophies musculaires de Duchenne et de Becker

Bases moléculaires des dystrophinopathies.
France Leturcq & Jean-Claude Kaplan
Laboratoire de Biochimie et Génétique Moléculaire, Hôpital Cochin et Institut Cochin , 123 Boulevard de Port-Royal, 75014 Paris

RESUME
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie héréditaire récessive liée au sexe. L’incidence de la maladie est de 1 cas sur 3500 naissances mâles, ce qui la classe dans la catégorie des maladies dites « orphelines » ou rares (fréquence <1/2000). Parmi les myopathies, c’est toutefois l’une des plus fréquentes. Elle est observée dans toutes les populations. Cette revue fait le point des avancées spectaculaires dans la connaissance de cette maladie depuis l’identification du gène responsable en 1986 Celui-ci code pour une molécule du cytosquelette sous sarcolemmique, la dystrophine. L’accent est mis sur l’impact de cette découverte sur le diagnostic moléculaire (protéine et lésion de l’ADN). Malgré le temps écoulé depuis la découverte du gène il n’existe toujours pas de thérapeutique dérivée de cette connaissance. Les différentes perspectives envisagées sont décrites.
Molecular bases of dystrophinopathies

SUMMARY
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is inherited in an X-linked recessive pattern and occurs at an incidence of 1 in 3500 male births, which means that it is a so-called “orphan” or rare disease (frequency <1/2000). Yet it is one of the most frequent myopathies and is observed in all populations. In this review we take stock of the spectacular advances made in our understanding of this disease since the identification in 1986 of the gene responsible. This gene encodes a subsarcolemmal component of the cytoskeleton, dystrophin. We consider the impact of this discovery on molecular diagnosis (protein and DNA lesion). Despite the time that has passed since, the discovery of the gene has not led to any treatment, and we review the therapeutic outlook.

Perspectives des thérapies cellulaires dans la dystrophie musculaire de Duchenne.
Alain Sebille
Atelier de Régénération Neuromusculaire
Faculté de Médecine Saint Antoine
27 rue Chaligny 75012 Paris

Introduction
Le muscle squelettique strié est constitué de fibres postmitotiques multinucléées qui sont les agents de la contraction. Ces fibres résultent de la fusion de cellules mononuclées précurseurs ayant migré des somites vers l’emplacement du muscle. La cascade d’événement qui conduisent à la différentiation myogénique de ces cellules est aujourd’hui bien détaillée (Sabourin et Rudnicki, 2000). Certaines cellules précurseurs présentes dans le muscle adulte sont nommées cellules satellites (Mauro, 1961) du fait de leur localisation entre la membrane plasmique et la matrice extracellulaire de la fibre musculaire. A cause de leur rôle dans la croissance et la régénération du muscle, elles ont été les premières cellules candidates pour traiter les dystrophies musculaires . Malgré de nombreuses données expérimentales positives sur la transplantation de ces cellules, aucun résultat clinique effectif n’a été obtenu à ce jour. Toutefois cette attente de résultats a permis une réflexion très riche sur l’hétérogénicité de ces cellules précurseurs musculaires et sur leur mode possible d’administration.
SUMMARY NOT AVAILABLE

Traitement Pharmacologique des Myopathies de Duchenne et de Becker.
Vincent Voisin, Sabine de la Porte
Laboratoire de Neurobiologie Cellulaire et Moléculaire, CNRS UPR 9040, Avenue de la Terrasse, 91198 Gif sur Yvette cedex, France

RESUME

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique sévère liée au chromosome X qui touche 1 garçon / 3500. Cette pathologie est due à l’absence d’une protéine du cytosquelette située sous le sarcolemme, la dystrophine, entraînant une dégénérescence progressive des tissus musculaires (lisses, squelettiques et cardiaque). Une forme moins sévère de la maladie, la dystrophie musculaire de Becker (DMB), se caractérise par la présence d’une dystrophine tronquée semi-fonctionnelle ou de la forme entière de la dystrophine en quantité réduite. Trois grandes classes de thérapie sont à l’étude actuellement : la thérapie génique, la thérapie cellulaire et la thérapie pharmacologique. L’une des stratégies retenue consiste à sur-exprimer l’utrophine, une protéine homologue à plus de 80% avec la dystrophine, puisque l’utrophine est capable d’assurer les fonctions cellulaires de la dystrophine. Dans cette revue, nous présenterons les études de thérapie pharmacologique. On peut distinguer trois approches : celle qui vise à améliorer le phénotype dystrophique, celle qui vise à ré-exprimer la dystrophine ou celle qui vise à sur-exprimer l’utrophine.
Pharmacological Treatments for Duchenne and Becker Dystrophies.
SUMMARY
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe X-linked genetic disease affecting 1 boy/3500. DMD is due to the lack of a submembranous cytoskeletal protein named dystrophin, leading to the progressive degeneration of skeletal, cardiac and smooth muscle tissue. A milder form of the disease, Becker muscular dystrophy (BMD), is characterised by the presence of a semi-functional truncated dystrophin, or the full-length dystrophin at reduced level. Three different therapeutic approaches are currently under study: gene therapy, cellular therapy and pharmacological therapy. One of the chosen strategies consists of the overexpression of utrophin, a protein 80% homologous with dystrophin, and able to perform similar functions. In this review, we shall consider studies of pharmacological therapy, the aims of which can be classified in three categories: reversal of dystrophic phenotype, dystrophin expression, utrophin overexpression

A propos d’un essai de Phase I de thérapie génique effectué avec un plasmide contenant l’intégralité du gène dystrophine dans la Myopathie de Duchenne / Becker 
Michel Fardeau *, Serge Braun **, Norma B. Romero *, J.Y. Hogrel *, Andrée Rouche *, Véronique Ortega *, Brigitte Mourot **, Patrick Squiban **, Olivier Benveniste ***, Serge Herson ***,
* Institut de Myologie et Inserm U582, Bâtiment Babinski, Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière – 75651 Paris Cedex 13
** Transgène S.A, 67000 Strasbourg
*** Département de Médecine Interne, Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière – 75651 Paris Cedex 13

RESUME
Un premier essai de thérapie génique a été réalisé chez des patients atteints de myopathie de Duchenne / Becker, à l’aide d’un plasmide contenant l’intégralité de la séquence codante du gène dystrophine. Cet essai de Phase I était destiné à apprécier le degré de transfection obtenue et à évaluer la tolérance au produit injecté ainsi qu’à l’expression du segment de dystrophine nouvellement synthétisé.
Neuf patients ont été inclus dans l’essai, répartis en trois cohortes de trois. La première cohorte a reçu une injection intramusculaire dans les muscles radicaux de 200µg, la seconde une injection de 600µg, et la troisième deux injections à deux semaines d’intervalle de 600µg. L’inclusion des patients s’est faite de façon séquentielle, après examen des résultats du patient précédent par un comité de pilotage comprenant des experts indépendants. Le plasmide a été retrouvé dans les neuf prélèvements effectués 3 semaines après la première (ou unique) inection. Une expression de la dystrophine exogène a été retrouvée chez 6 patients sur 9. Cette expression a toujours été faible, jusqu’à 6% de fibres présentant un marquage périphérique complet, et jusqu’à 26% de fibres présentant un marquage partiel. Les messagers de la dystrophine ont été détectés par une RT-PCR « nichée » dans cinq des six prélèvements présentant des fibres marquées. Il est remarquable de noter qu’aucune réponse immunitaire humorale ou cellulaire vis-à-vis de la dystrophine exogène n’a été détectée. Aucune réaction secondaire locale ou générale n’a été observée.
Ces résultats, modestes mais significatifs, ouvrent la voie à de nouveaux développements en terme de thérapie génique des maladies musculaires humaines, et en particulier dans les myopathies de Duchenne et de Becker.

About a Phase I gene therapy clinical trial with a full-length dystrophin gene-plasmid in Duchenne/Becker Muscular Dystrophy
Summary
This is the first report on gene transfer into Duchenne / Becker patients. The aim of the study was to provide evidence on transgene expression and safety of the intra-muscular administration of a plasmid containing a full-length dystrophin ¢DNA.
Nine Duchenne / Becker patients distributed in three cohorts of 3 patients, were injected into their radialis muscles either once with 200µg (first cohort) or 600µg (second cohort) or twice, two weeks apart, with 600µg plasmidic DNA. The patients were enrolled sequentially upon evaluation of the data by an independant pilot committee. In the biopsies taken 3 weeks after the initial injection from the injected site, the plasmid was detected in all patients. An exogenous dystrophin expression was found in 6/9 patients. The level of expression was low, up to 6% of weak complete sarcolemmal labelling, and up to 26% of partial sarcolemmal staining. Dystrophin in RNAs were detected by nested RT-PCR in five out of the six biopsies with exogenous dystrophin-positive fibers. Interestingly, neither humoral or cellular antidystrophin responses were observed. No local or general adverse effects were seen.
This paves the way for future developments in gene therapy in hereditary muscle diseases, and specifically in Duchenne / Becker myopathies.

Séance du 20 octobre 2004

La jonction neuromusculaire

Utilisation du fragment C-terminal de la neurotoxine tétanique pour visualiser et analyser des connexions neuronales ainsi que pour le transfert d'une activité biologique associée.
Sylvie Roux 1, 2 ; Cécile Saint Cloment 2 ; Thomas Curie 2 ; Emmanuelle Girard 1 ; Philippe Brûlet 2 et Jordi Molgó 1.
1 Laboratoire de Neurobiologie Cellulaire et Moléculaire, Unité Propre de Recherche 9040, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut Fédératif de Neurobiologie Alfred Fessard, 91198 Gif-sur-Yvette, France
2 Unité d’Embryologie Moléculaire, Institut Pasteur, Unités de Recherche Associées 2578, Centre National de la Recherche Scientifique, 25 rue du Dr Roux, 75724 Paris, France

RESUME 
Tout en étant dépourvu de toxicité, le fragment C-terminal de la neurotoxine tétanique ou fragment TTC conserve les propriétés de transport rétrograde et trans-synaptique de la toxine native. L’association du fragment TTC avec un marqueur fluorescent ou avec la ß-galactosidase facilite sa détection. Ces marqueurs ont donc logiquement été utilisés pour visualiser et étudier les connexions neuronales établies. Dans cette revue de synthèse, nous développerons les potentialités des différentes approches utilisées à savoir l'injection de protéine purifiée, l'utilisation d’adénovirus et la transgénèse. Comme l’activité nerveuse joue un rôle essentiel dans l’internalisation du fragment TTC, la fonctionnalité des connexions ainsi visualisées peut être également appréhendée. Des modifications quantitatives du transport rétrograde neuronal peuvent être également détectées. Le fragment TTC représente donc un excellent outil pour analyser la connectivité et la fonctionnalité d’un réseau neuronal. D’autre part, le fragment TTC a été très rapidement préssenti comme un vecteur particulièrement intéressant pour le transport et la libération d’activité biologique ou encore de gènes au sein d’un réseau neuronal. Dans cette optique, des constructions contenant un domaine de translocation membranaire permettant la libération cytosolique de l’activité biologique associée ont été étudiées. Enfin, nous rapporterons les premiers résultats, particulièrement encourageants, obtenus avec le fragment TTC pour cibler exclusivement aux neurones l’action d’un facteur neurotrophique. Cette spécificité d’action permettrait alors d’éviter des effets secondaires dus à une action de ces facteurs sur d’autres cellules que les neurones.
C-terminal fragment of tetanus toxin: its use in neuronal network analysis and its potential as non-viral vector.
SUMMARY
The atoxic C-terminal fragment of tetanus neurotoxin or TTC fragment presents similar retrograde and transsynaptic properties to the holotoxin. Detection of this fragment is easier when it is associated with a fluorescent marker or with ß-galactosidase activity by genetic fusion or chemical conjugation. Thus, the corresponding tracers have been used to study and analyse the synaptic connections of a neural network. In this article, we shortly review the various methods used to this aim including : injection of the corresponding fusion protein, adenovirus in vivo expression and transgenesis. Since neural activity is essential for neuronal TTC binding and internalization, the functionality of connections can be also evaluated. Moreover, modifications of the retrograde transport can be also detected by using this fragment. Thus, TTC fragment is an excellent tracer to analyse the connectivity and functionality of a neural network. The TTC fragment has been also rapidly proposed to be used as potential therapeutic vector to transport and to deliver a biological activity or gene in a neural network. To this aim, the efficiency of a translocation domain to induce the cytosolical release of the associated activity has been evaluated. The use of the TTC fragment to target specifically a neurotrophic factor to neurons and thus avoid secondary effects has been tested with interesting results.

Rôle des toxines dans l’étude fonctionnelle et structurale des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine.
Carole Fruchart-Gaillard & Denis Servent

CEA. Département d’Ingénierie et d’Etudes des Protéines. CE Saclay. 91191 Gif/Yvette.

Résumé

Les toxines animales ont souvent été très utiles dans la compréhension des modes de fonctionnement de leurs différentes cibles. Celles qui interagissent au niveau des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine sont purifiées à partir de venin de serpents ou de cônes marins. De par leur haute affinité et leur sélectivité d’interaction, ces toxines sont utilisées depuis une trentaine d’années comme de véritables sondes moléculaires permettant d’identifier, de localiser et de purifier ces récepteurs. Par ailleurs, ces toxines ont joué un rôle majeur dans la compréhension des spécificités fonctionnelles des différents sous-types de récepteurs et ont permis d’accéder à des informations structurales les concernant. L’obtention de ces toxines par voie chimique ou recombinante, l’introduction de résidus non-naturels au sein de leurs séquences et la connaissance structurale de leur site d’interaction permet d’envisager la conception de nouveaux ligands ayant des sélectivités prédéfinies et pouvant avoir un intérêt en tant qu’outil pharmacologique et/ou agent thérapeutique dans les nombreuses pathologies impliquant ces récepteurs.
Critical role of peptidic toxins in the functional and structural analysis of nicotinic acetylcholine receptors.
Summary
Animal toxins which interact on various receptors and channels have been often used in the studies of the functional roles of these targets. Nicotinic toxins have been purified from snake and cone venoms and are characterized by high affinity and various selectivity of interactions on the different nicotinic receptors subtypes. Since 30 years they have been used as molecular probes to identify, localize and purify these receptors. Furthermore, they have played a crucial role in the better understanding of their functional properties and have been useful in their structural studies. These peptidic toxins could be chemically synthetized or recombinantly expressed and non-natural residues could be introduced in their sequences in order to delineate their functional interaction sites. The structural modelisation of toxin-nAChR interaction allow us to understand the antagonistic property of these toxins and open the way to the design of engineered ligands with predetermined specificty, useful as pharmacological tools or therapeutic agents in the numerous diseases involving this receptor family.

Les chlolinestérases : des enzymes ancrées dans les membranes et les lames basales
Eric Krejci

Laboratoire Biologie des jonctions neuromusculaires normales et pathologiques
IFR95, Université Paris75005 45 rue des Saints-Pères 75006 Paris

RESUME
L'acétylcholinestérase (AChE) et la butyrylcholinestérase (BChE) sont deux enzymes qui hydrolysent l'acétylcholine. Elles sont organisé en deux domaines : le domaine catalytique et un domaine d'organisation du tétramère. Ce tétramère est préférentiellement organisé par le domaine riche en proline de deux protéines caractérisées par leur association avec l'AChE, un collagène particulier ColQ et un petite protéine transmembranaire PRiMA. ColQ localise l'AChE dans les lames basale et PRiMA sur la membrane plasmique.
Le complexe ColQ/AChE présente une forte concentration dans la lame basale des jonctions neuromusculaires, plusieurs processus assurent son accumulation.
Les conséquences fonctionnelles de l'absence d'AChE sont multiples mais la désensibilisation des récepteurs nicotiniques n'est pas la cause primaire ou majeure qui explique la faiblesse musculaire observée après inhibition de l'AChE ou en absence d'AChE chez les patients qui portent des mutations dans ColQ.
The cholinestérases  : anchored enzymes in membranes and basal lamina

Summary
Two proteins, ColQ and PRiMA organize tetramers of acetylcholinesterase (AChE) and of butyrylcholinesterase (BChE) throught peptide interactions. A short proline rich sequence in N-terminal domain of ColQ or PRiMA associates four C-terminal extension of AChE or BChE. ColQ targets the enzymes in the basal lamina, PRiMA targets the enzymes at the plasma membrane. These complexes represent the mature protéins. The unassembled C-terminal extention of AChE is the key determinant recognized during the "quality control" of protein synthesis. Unassembled catalytic subunits are then degraded by the proteasome pathway.
At the neuromuscular junction, ColQ/AChE represents the concentrated enzyme. The clusterisation of AChE depends upon ColQ throught 3 sites of interactions: two different heparin binding domains in the collagen domain interact with heparan sulfate proteoglycan particularly the perlecan and the C-terminal non collagenic domain with MuSK, the tyrosine kinase receptor organiser of the neuromusuclar junction.
The absence of ColQ and AChE has revealed that the excess of Ach stimulates more nicotinic receptors but probably not until their desensitization. Several morphological modifications may help to the clearence of Ach. Conversely the synpase transmission failed during high frequency of nerve stimulation.

Caractérisation physiopathologique des syndromes myasthéniques congénitaux : l’exemple de mutations dans le gène MUSK
Frédéric Chevessier 1, Brice Faraut 1, Aymeric Ravel-Chapuis 2, Pascale Richard 1,3, Karen Gaudon 1,3, Stéphanie Bauché 1, Cassandra Prioleau 1, Ruth Herbst 4, Evelyne Goillot 2, Christine Ioos 1, Jean-Philippe Azulay 5, Shahram Attarian 5, Jean-Paul Leroy 1,6, Emmanuel Fournier 7, Claire Legay 8, Laurent Schaeffer 2, Jeanine Koenig 1,9, Michel Fardeau 1, Bruno Eymard 1,10,
Jean Pouget 5 and Daniel Hantaï 1

1 INSERM U582 & IFR 14, Institut de Myologie, Hôpital de la Salpêtrière and Université Pierre et Marie Curie, Paris, France. 2 CNRS/ENS UMR 5161 & IFR128, École Normale Supérieure, Lyon, France. 3 Unité Fonctionnelle de Cardiogénétique et Myogénétique, Service de Biochimie B & IFR 14, Hôpital de la Salpêtrière, Paris, France. 4 Brain Research Institute, Medical University Vienna, Vienne, Autriche. 5 Service de Neurologie et Maladies Neuromusculaires, Hôpital Universitaire La Timone & IFR 131, Marseille, France. 6 CHU Morvan, Brest, France. 7 Service d’Electrophysiologie & IFR 70, Hôpital de la Salpêtrière, Paris, France. 8 CNRS UMR 8544, École Normale Supérieure, Paris, France;
9 Université Bordeaux II, Bordeaux, France. 10 Fédération de Neurologie Mazarin & IFR 70, Hôpital de la Salpêtrière, Paris,
France.
RESUME

Les syndromes myasthéniques congénitaux (SMC) sont des maladies génétiques rares affectant la jonction neuromusculaire (JNM) et caractérisés par un dysfonctionnement de la neurotransmission. Ils forment un ensemble hétérogène sur le plan physiopathologique et peuvent être classés en trois groupes selon leur origine : présynaptique, synaptique ou postsynaptique.
Nous rapportons ici pour la première fois que des mutations dans le gène codant pour une molécule postsynaptique, le récepteur tyrosine kinase spécifique du muscle, MuSK, sont responsable d’un SMC postsynaptique. L’analyse génétique a permis d’identifier deux mutations hétéroalléliques, une mutation entraînant un décalage du cadre de lecture (c.220insC) et une mutation faux-sens (V790M). La biopsie musculaire a montré des anomalies importantes à la fois pré et postsynaptiques de la structure de la jonction neuromusculaire et une diminution sévère de l’expression de la sous-unité ? du récepteur de l’acétylcholine (RACh) et de MuSK.
Des expériences in vivo et in vitro ont été réalisées en utilisant des mutants de MuSK reproduisant les mutations humaines. La mutation décalant le cadre de lecture conduit à l’absence de l’expression de MuSK. La mutation faux sens n’affecte pas l’activité catalytique kinase de MuSK mais diminue son expression et sa stabilité conduisant à une diminution de l’agrégation du RACh sous la dépendance de l’agrine.
Ces résultats suggèrent fortement que la mutation faux sens, en présence de la mutation nulle sur l’autre allèle, est responsable des modifications synaptiques très importantes observées chez le patient.

Pathophysiological characterization of congenital myasthenic syndromes: The example of mutations in the MUSK gene
SUMMARY
Congenital myasthenic syndromes (CMS) are rare genetic diseases affecting the neuromuscular junction (NMJ) and are characterized by a dysfunction of the neurotransmission. They are heterogeneous at their pathophysiological level and can be classified in three categories according to their presynaptic, synaptic and postsynaptic origins.
We report here the first case of a human neuromuscular transmission dysfunction due to mutations in the gene encoding a postsynaptic molecule, the muscle-specific receptor tyrosine kinase (MuSK). Gene analysis identified two heteroallelic mutations, a frameshift mutation (c.220insC) and a missense mutation (V790M). The muscle biopsy showed dramatic pre- and postsynaptic structural abnormalities of the neuromuscular junction and severe decrease in acetylcholine receptor (AChR) ?-subunit and MuSK expression.
In vitro and in vivo expression experiments were performed using mutant MuSK reproducing the human mutations. The frameshift mutation led to the absence of MuSK expression. The missense mutation did not affect MuSK catalytic kinase activity but diminished expression and stability of MuSK leading to decreased agrin-dependent AChR aggregation, a critical step in the formation of the neuromuscular junction. In electroporated mouse muscle, overexpression of the missense mutation induced, within a week, a phenotype similar to the patient muscle biopsy: a severe decrease in synaptic AChR and an aberrant axonal outgrowth.
These results strongly suggest that the missense mutation, in the presence of a null mutation on the other allele, is responsible for the dramatic synaptic changes observed in the patient.